Metode kromatografi cair kinerja tinggi yang sederhana dan sensitif telah dikembangkan dan divalidasi untuk analisis asiklovir dalam plasma manusia in vitro. Sampel plasma diendapkan proteinnya dengan metanol. Pemisahan komponen dalam ekstrak plasma dilakukan dengan kolom C18 Partisil 5 ODS-3 (Whatman) dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Fase gerak terdiri dari metanol-larutan natrium dihidrogen fosfat monohidrat 0,05 M (4:96, v/v) pH 6,6 yang mengandung natrium dodesil sulfat (200 mg/L, b/v) dan trietilamin (2 ml/L, v/v) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit. Vanilin digunakan sebagai baku dalam. Kurva kalibrasi linear (r=0,9997) pada rentang konsentrasi 0,0404-3,0300 μg/ml. Lower Limit of Quantitation (LLOQ) adalah 0,0404 μg/m. Nilai koefisien variasi dan % diff pada tiga konsentrasi asiklovir yang berbeda adalah lebih rendah dari 15%. Uji perolehan kembali asiklovir diperoleh antara 86,3476-107,0325%. Hasil validasi metode memenuhi kriteria yang ditetapkan.